Генотипування головного комплексу гістосумісності генів II класу

HLA-DR  методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

(ІНСТРУКЦІЯ)

Методика використовує сіквенс-специфічну реакцію ПЛР (PCR-SSP), яка працює при повній сумісності послідовності праймеру з послідовністю матриці  аллелі гену, що ампліфікується. 

Комплектація набору

Mix №№ 1-19  – безбарвні пробірки з ліофілізованими праймерами - по 55  пробірок кожного номеру, загалом 1045 пробірок  (відповідність номеру Міксу алельному варіанту або групі алелів дивитись в табл.2); зберігати при +4 °С

ПЛР-буфер          -  2,2  мл;                            - зберігати при -20 °С

MgCl_{2                      -}  2,2   мл.                          - зберігати при -20 °С

Суміш dNTP (10mM) – 0,44 мл                     - зберігати при -20 °С

Tag-полимераза (5ед/мкл)      - 0,22 мл    - зберігати при -20 °С  

Протокол  проведення  ПЛР.

1. Перед початком реакції дістати з холодильника потрібну кількість ПЛР-пробірок з праймерами, по одній на кожен зразок ДНК відповідно.
2. Промаркувати відповідним чином необхідну кількість пробірок, в тому числі і (-) контроль.
3. Додати в усі пробірки по 18 мкл ПЛР-суміші, приготовану в співвідношенні, як приведено в таблиці. Кількість реактивів приведно з розрахунку на 1 пробірку:

Таблиця 1

4. Внести в пробірки по 2 мкл ДНК, що досліджується. Загальний обсяг реакційної суміші складає  20 мкл.

Увага!  Для запобігання контамінації і хибно-позитивних результатів при роботі з зразками рекомендовано використовувати спеціальні наконечники з антиаерозольними фільтрами.

5. Перенести пробірки в термоблок програмовного термостату і розпочати наступну  програму ампліфікації:

6. Післе закінчення ампліфікації всі пробірки перенести в кімнату для проведення електрофорезу (детекції) ДНК. Використовувати для аналізу 2-5 мкл ПЛР продукту. Для візуалізації продуктів ампліфікації використовувати 2,5%, агарозний гель. Розділення фрагментів рекомендовано проводити при напруженості 5-7 В/см протягом 30 хвилин.

Обробка результатів аналізу

1. В деяких пробах (в двох і більше одночасно), маркованих номерами від 1 до 19, повинна бути візуалізована  смужка ДНК чітко визначеної молекулярної ваги, яка визначає алельну специфічність і гетеро- або гомозиготність (табл. 2).
2. Наявність смужки в негативному контрольному зразку визначається як результат контамінації. При  цьому результати аналізу  повинні бути анульовані.
3. Наявність слабких смужок жовтого кольору, розташованих нижче або вище специфічних смужок, може бути результатом неспецифічної ампліфікації, які не повинні прийматись до уваги.
4. Проти лунки для Маркера молекулярної ваги повинні бути візуалізовані полоси вагою 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 и 500 пн за допомогою яких можливо визначити приблизні розміри специфічних смуг (табл. 2).

    Таблиця 2.

Написати відгук

Ваше Ім’я:

Рейтинг

Добре
entry_bads
Ваш відгук:
Добавить фото

Ссылка на фото:

Введіть код, вказаний на зображенні:

Продовжити